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Arnaldoa

versión impresa ISSN 1815-8242versión On-line ISSN 2413-3299

Arnaldoa vol.26 no.1 Trujillo ene./abr. 2019

http://dx.doi.org/10.22497/arnaldoa.261.26121 

ARTÍCULOS ORIGNALES

Actividad antioxidante in vitro y compuestos fenólicos de las hojas de Beautempsia avicenniifolia (Kunth) Gaudich (Capparaceae)

Antioxidant activity in vitro and phenolic compounds of leaves of Beautempsia avicenniifolia (Kunth) Gaudich (Capparaceae)

 

Víctor E. Villarreal La Torre1, Cesar Gamarra Sánchez1, Carmen Silva Correa1, José Cruzado Razco1, Guillermo Ruiz Reyes1, Noé Costilla Sánchez2, Luis Zevallos Torres2,Juan Marlon García Armas3

1 Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad Nacional de Trujillo, PERÚ.

2 Facultad de Ingeniería Química, Universidad Nacional de Trujillo, PERÚ.

3 Universidad Privada Antenor Orrego, Av. América Sur 3145, Urb. Monserrate, Trujillo, PERÚ


Resumen

El objetivo de este trabajo fue determinar la concentración de los compuestos fenólicos presentes en las hojas de Beautempsia avicenniifolia (Kunth) Gaudich (Capparaceae) y su capacidad antioxidante, con el propósito de encontrar una nueva alternativa para combatir el estrés oxidativo y las enfermedades crónico degenerativas, problemas de salud de interés actual. Las hojas fueron tomadas del tercio medio de la planta, luego lavadas y secadas a temperatura ambiente y en oscuridad. Se trituraron, tamizaron y los polifenoles fueron extraídos con metanol y secado a rotavapor. El extracto seco se resuspendió en metanol y se cuantificaron los polifenoles totales con el reactivo de Folin-Ciocalteu por espectrofotometría molecular. Los flavonoides en términos de quercetina fueron determinados por HPLC y la actividad antioxidante, por espectrofotometría molecular mediante la reducción del radical 2,2-difenol-1-picrilhidrazil (DPPH). El contenido de compuestos fenólicos fue de 0,0237 ± 0,0002 g%, el de quercetina de 23,8873 mg% y se encontró una capacidad antioxidante lenta, con una IC50 de 0,3984 ± 0,0286 mg de quercetina. Como conclusión, la concentración de compuestos fenólicos con capacidad reductiva es medianamente alta, de los cuales una gran concentración son flavonoides de polaridad media a baja; los flavonoides fueron identificados mediante ensayos IR y demostraron tener una capacidad antioxidante in vitro de cinética lenta.

Palabras clave: Capparaceae, polifenoles, antioxidante, quercetina.


Abstract

The objective of this work was to determine the concentration of phenolic compounds in leaves of Beautempsia avicenniifolia (Kunth) Gaudich, and its antioxidant capacity, in order to find a new alternative to treat oxidative stress and chronic degenerative diseases, health problems of current interest. The leaves were taken from the middle third of the plant, then washed and dried at ambient temperature and under darkness. They were crushed, sieved and the polyphenols were extracted with methanol and dried on rotary evaporator. The dry extract was resuspended in methanol and the total polyphenols were quantified with the Folin-Ciocalteu reagent by molecular spectrophotometry. Flavonoids in terms of quercetin were determined by HPLC and the antioxidant activity by molecular spectrophotometry by the reduction of the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical (DPPH). The content of phenolic compounds was 0.0237 ± 0.0002 g%, of quercetin was 23.8873 mg% and a slow antioxidant capacity was found, with an IC50 of 0.3984 ± 0.0286 mg of quercetin. As conclusion, the concentration of phenolic compounds with reducing capacity is moderately high, of this a high concentration are flavonoids of medium to low polarity; the flavonoids were identified by IR assays and demonstrated to have an in vitro antioxidant capacity of slow kinetics.

Keywords: Capparaceae, polyphenols, antioxidant activity, quercetin.


Introducción

Beautempsia avicenniifolia (Kunth) Gau- dich (B. avicenniifolia) (Capparaceae) es un arbusto costero, que habita en las zonas desérticas, médanos y dunas, generalmente asociada a especies arbóreas y arbustivas; es fácil encontrarla también en zonas ribereñas o en los bordes de caminos, laderas rocosas, terrenos de aluvión, pedregosos, laderas abiertas, cercos y rastrojos, mezclándose con vegetación umbrófila o del bosque xerofítico de la costa como lo menciona Mostacero & Mejia (2009); por otro lado Iltis (1789), menciona que sus hojas suelen ser usadas en forma de cata plasma para aliviar dolores musculares y el sarpullido; también, es utilizado como antiescorbútico por su contenido en vitamina C, antineurítico y antiespasmódico.

Vidaurre et al. (2007) en su trabajo sobre las características farmacognósticas de las hojas de B. avicenniifolia, menciona que esta planta presenta aceites y grasas, triterpenos y esteroides, alcaloides, taninos, flavonoides, resinas, catequinas, antocianidinas y proteínas. A su vez, Villarreal & Soto (2015) en un análisis anatómico e histoquímico de las hojas de B. avicenniifolia, identificaron lípidos totales, esteroles, compuestos fenólicos totales, flavonoides, taninos, lignanos, aminoácidos y alcaloides. En ambos casos resalta la presencia de alcaloides, taninos y flavonoides, siendo estos últimos compuestos de gran importancia biológica actual según Saeed et al. (2012), por sus propiedades antioxidantes y anticancerígenas.

Chen et al. (2004) nos mencionan que es importante el consumo de compuestos fenólicos, como los flavonoides, cuando las defensas antioxidantes del organismo no son totalmente eficientes, ya que se incrementa la formación de radicales libres, mecanismo denominado como estrés oxidativo.

Saeed et al. (2012) adiciona que las especies reactivas de oxígeno (ROS), se forman tras la adición de electrones individuales, y están involucradas en el desarrollo de varias enfermedades y en la aceleración del envejecimiento causadas por el estrés oxidativo. Tanto ellos como

Ghasemi et al. (2009) dicen que el estrés oxidativo, es un factor que favorece, de manera importante, el desarrollo de enfermedades crónicas degenerativas como el cáncer, padecimientos cerebrales o cardíacos. Es generado por el desbalance de la producción de ROS y la defensa antioxidante del organismo, generando daños oxidativos; tanto Ismail et al. (2004) como Wolfe & Rui (2007) dicen que esto se puede dar por una deficiencia en los mecanismos de defensa antioxidante o por el incremento de ROS, por la exposición a elevadas concentraciones de ROS, una activación excesiva de ROS o por la presencia de toxinas metabolizadas por ROS, generado por inflamaciones crónicas o infecciones.

Además de ello, Serrano & Soriano (2010) nos recuerdan que tenemos a las enfermedades crónico degenerativas, que se han posicionado entre las primeras causas de muerte con un costo en morbilidad y complicaciones cada vez más alto. Dentro de estas enfermedades crónico degenerativas, que contribuyen a aumentar la prevalencia mundial de enfermedad muerte se encuentran las enfermedades neoplásicas, uno de los principales problemas de salud pública.

Es por ello que Wolfe & Rui (2007) rezaltan la importancia del consumo exógeno de antioxidantes por medio de la dieta, al incrementar la protección del cuerpo y ayudar a combatir enfermedades cardiacas y cáncer, además del interés por la búsqueda de nuevas fuentes naturales con contenido de polifenoles antioxidantes. Un polifenol, según Fu et al. (2017), puede ser definido como antioxidante si cumple con dos condiciones: (1) A bajas concentraciones relativas al sustrato a oxidar es capaz de detener, retardar o prevenir la autooxidación, o es mediador de la oxidación causada por los radicales libres; y (2) El radical formado como resultado de la reacción, debe de ser estable y no es capaz de participar en las reacciones en cascada de oxidaciones.

Huang et al. (2005) brindan diversos métodos para determinar la capacidad antioxidante se pueden dividir en dos grandes categorías: (1) Los basados en la reacción de transferencia de átomo de hidrogeno (HAT), que emplean un compuesto generador de radicales libres, un indicador molecular oxidable y un antioxidante; y (2) Los basados en las reacciones de transferencia de un solo electrón (ET), que constan de una reacción redox con el oxidante como indicador del final de la reacción

La capacidad de reducción del radical 2,2-difenol-1-picrilhidrazil (DPPH.), es un método HAT que consta en una mezcla de una solución metanónila de DPPH. con la solución de una sustancia antioxidante (Napavichayanun et al., 2017). Xie et al. (2008) dicen que la reacción es monitoreada a 515 nm por 45 minutos o hasta que la absorbancia sea estable. Al término de la reducción, el color de la solución desaparece y se calcula el porcentaje de inhibición. Una desventaja de este método es que muchas sustancias con actividad antioxidantes que reaccionan con radicales peroxilo, no reaccionan o reaccionan lentamente con DPPH.

Los compuestos fenólicos, como los flavonoides de las hojas de B. avicenniifolia son fuente de compuestos antioxidantes naturales, y en la actualidad son apreciados por su actividad biológica, para el tratamiento y prevención de ciertas enfermedades crónicas degenerativas, además, se conoce que la B. avicenniifolia es una planta endémica y se encuentra en zonas de fácil acceso.

Materiales y métodos

Las hojas de B. avicenniifolia fueron recolectadas del distrito de San Pedro de Lloc, provincia de Pacasmayo, departamento de La Libertad; lugar situado a los 7°26’30’’S, 79°29’43’’O y a 51 m.s.n.m., la identificación botánica se realizó en el herbarium Truxillensis (HUT) de la Universidad Nacional de Trujillo.

Los compuestos fenólicos fueron extraídos utilizando como base lo estipulado por Barrón et al. (2011) y Serrano & Soriano (2010), por lo cual se empleó 0,5 g de muestra seca y 10 mL de metanol, agitando la mezcla durante 30 minutos. Concluido el tiempo, se centrifugó la muestra para separar el sólido, al que se le adicionó nuevamente 10 mL de metanol, manteniendo en agitación por 30 minutos. Posteriormente se combinó los extractos y se concentraron en un rotaevaporador hasta obtener un extracto seco.

Para la identificación de compuestos fenólicos por coloración, se depositó tres gotas del extracto metanólico en una depresión de la placa de toque y se le adicionó una microgota de solución de tricloruro férrico al 10%; además, se realizó el ensayo de Shinoda según Lock (2016) y Domínguez (1988).

La concentración de fenoles totales en los extractos fue determinada por espectrofotometría, basándose en la reacción colorimétrica de óxidoreducción, empleando como agente oxidante el reactivo de Folin-Ciocalteu, siguiendo la metodología descrita por Ghamesi et al. (2009).

La extracción de flavonoides fue realizada según Martinez (2010) por lo que se empleó 0,5 g de muestra seca desengrasada con 10mL de éter de petróleo, que fue macerada en 10 mL de etanol 70% por una hora en ultrasonido. Posteriormente, el extracto se concentró por calentamiento no superior a 50°C en rotaevaporador y fue fraccionado con éter etílico (extracción de flavonoides apolares), acetato de etilo (extracción de flavonoides medianamente polares) y n-butanol (extracción de flavonoides polares – glocósidos). Cada fracción fue analizada por HPLC (Fu et al., 2017) encontrándose mayor concentración en la fracción con éter etílico. En el análisis por HPLC se empleó columna RP-18, detectando a 254 nm y eluyendo con mezclas de acetonitrilo/ agua con ácido acético al 1% en diferentes proporciones, y empleando quercetina como sustancia patrón.

En el análisis por espectrofotometría infrarrojo (IR) del extracto etanólico se utilizó 30 g de muestra seca desengrasada con tres porciones de 30 mL de éter de petróleo, la que se maceró con 50 mL de etanol 70% por una hora en ultrasonido. El extracto obtenido se evaporó con calentamiento no superior a los 50°C en rotaevaporador y posteriormente se eliminó la mayor cantidad de clorofila y sustancias no polares bajo particiones con cloroformo. El marco fue resuspendido en< 2 mL de alcohol absoluto y se analizó por IR (Martinez, 2010).

La capacidad de reducción del radical DPPH. se evaluó agregando 300 μL de solución de DPPH. en metanol (0,5 mM) y se mezcló con 5 mg de muestra diluida en 3 mL de metanol. El decremento de absorción fue monitoreado a 517 nm después de 45 minutos de reacción. El porciento de inhibición del radical fue calculado con la siguiente fórmula:

Resultados

La identificación taxonómica de la especie B. avicenniifolia se realizó en el Herbarium Truxillensis de la Universidad Nacional de Trujillo (el número del depósito legal es: 50973), donde se determinó que la especie vegetal recolectada era la de interés y tiene la siguiente clasificación taxonómica descrita por Ulloa et al. (2017):

Clase: Equisetopsida C. Agardh

Subclase: Magnoliidae Novák ex Takht. Superorden: Rosanae Takht.

Orden:

Brassicales Bromhead Familia: !!Capparaceae Juss. Género: Beautempsia Gaudich.

El ensayo con solución de tricloruro férrico al 10% determinó la presencia de compuestos fenólicos en los extractos realizados a partir de B. avicenniifolia.

Los compuestos fenólicos totales fueron determinados por el método de Folin– Ciocalteu y son reportados como equivalentes a ácido gálico por la curva estándar (Y = 25,81X – 0,1126; R2=0,9993) y dando como resultado una concentración de 0,0237±0,0002g en 100g de hojas.

La determinación de la concentración de flavonoides se realizó, empleando quercetina como estándar y mediante Cromatografía Líquida de Alta Performance (HPLC), en tres extractos de distintas polaridades, mostrando que 100g de hojas contienen 23,8873mg de flavonoides totales, de los cuales 10,5956mg son medianamente polar y 13,2917mg son apolares.

Aunque el espectro infrarrojo de los flavonoides no se usa mucho actualmente, a manera corroborativa se obtuvo el espectro infrarrojo del extracto etanólico de Capparis avicenniifolia Kunth del cual se identificaron los distintos picos y bandas mostrados en la Tabla 1.

Finalmente, el extracto presentó actividad antioxidante detectable, al capturar radicales libres del DPPH en medio líquido, actividad antioxidante presentada como IC50 en la Tabla 2.

Discusión

El ensayo con tricloruro férrico al 10% confirma la presencia de compuestos fenólicos en las hojas de B. avicenniifolia tal y como lo menciona Vidaurre (2007) y Villarreal (2015); la reacción mostró una coloración azul-negra, afirmando que los compuestos fenólicos presentes derivan del ácido gálico, esto permitió continuar con la cuantificación empleando ácido gálico como estándar (Domínguez, 1988).

La cuantificación colorimétrica de compuestos fenólicos por el método Folin – Ciocalteu mostró una cantidad nada despreciable de estos compuestos, contrastando estos resultados con el trabajo realizado por Gracia (2006) sobre "Cuantificación de Fenoles y Flavonoides

Totales en Extractos Naturales", en la Universidad Autónoma de Querétano en México, se puede observar que esta planta contiene una mayor cantidad de compuestos fenólicos que la Malva sylvestris y el Chenopodium murale, sin embargo, los "berros" (Nasturtium officinale), la "hierba de venado" (Damianaturnera diffusa willd), entre otras contienen una cantidad considerablemente mayor de compuestos fenólicos, además de ello, Singleton et al., (1998) fundamenta este método como una reacción óxido – reducción, que permite aseverar que precisamente estos agentes fenólicos tienen actividad antioxidante, lo que ratificamos con nuestros hallazgos mediante el ensayo con DPPH.

Los flavonoides son uno de los compuestos fenólicos más importantes al ser responsable mayoritariamente de las acciones antioxidantes (Domínguez, 1988), siendo la quecetina uno de los más reconocidos por sus propiedades antioxidantes por lo que es importante cuantificar los flavonoides equivalentes a quercetina. Múltiples estudios, como el de Barrón et al. (2011), han asociado la presencia de este metabolito con la actividad antioxidante de una amplia variedad de frutos y otras especies y, aunque es poco probable la presencia de quercetina en estás hojas al no hallarse flavonoides en la fracción n-butanólica (polar), se puede presumir que la actividad antioxidante se deba a los flavonoides presentes en las fracciones de éter etílico y acetato de etilo (apolares y medianamente polares respectivamente) ya que múltiples estudios describen que algunos de sus derivados glicosídicos de quercetina presentan menor actividad antioxidante que la aglicona por la unión del azúcar al OH del C – 3 (Martinez, 2010), por otro lado, Mithen et al. (2010) describe que muchas especies del género Capparaceae contienen glucosinolatos, principalmente glucosinolato de metilo, sustancia que no fue hallada en este sistema pero que Camacho (2012) si encuentra en especies localizadas en el departamento de Lambayeque – Perú.

En el espectro infrarrojo se observa la banda representativa del radical hidroxilo a los 3300 cm-1 y el pico representativo a los carbonílicos a los 1625 cm-1, radicales presentes en algunos tipos de los flavonoides y con lo cual podemos aseverar su presencia en las hojas de esta planta (Martinez, 2010), aunque no podemos precisar el flavonoide presente, si podemos identificar a que grupo pertenece, pues la técnica solo nos permite determinar los grupos funcionales mas no la estructura en sí, y más aun tratándose de una familia tan grande y diversa como son los flavonoides. Los grupos funcionales identificados (hidroxilos y carbonilos) nos permiten inferir que los tipos de flavonoides presentes pueden ser flavonoles o flavanonoles, pues ambos tipos presentan grupos hidroxilos y carbonílicos; sin embargo, esto es factible de solo estar presente un único tipo de flavonoides (Domínguez, 1988).

La actividad antioxidante por captura de radicales libres del DPPH en medio líquido, confirma la actividad antioxidante, la cual es presentada como IC50 (Tabla 02), que es la concentración de antioxidante necesaria para inhibir el 50% de radicales libres. Sánchez-Moreno (2002) clasificó el desempeño antioxidante de varias sustancias de acuerdo con la cinética de la reacción, como: <5 min, rápida; entre 5 y 30 min, intermedia; y >30 min como lenta; para este caso, la muestra tuvo una cinética lenta (Sanchez, 2002).

Aunque la actividad antioxidante es generalmente atribuible a los compuestos fenólicos, estos no son los únicos compuestos que pueden presentar esta actividad, múltiples efectos sinérgico que presenta los flavonoides con tocoferoles, palmitato ascorbil, ácido cítrico ya han sido reportados (Hraš et al., 2000).

 

Contribución de los autores

VVLT.: Concepción, diseño, recolección de datos y aprobación final; NCS: Análisis e interpretación de datos, aprobación final; LZT: Análisis de datos y revisión crítica; CGS: Interpretación de resultados, aprobación final; CSC: Análisis Fitoquímico y cromatográfico; GRR: Análisis Fitoquímico y de IR; JMGA: Análisis e interpretación de datos, aprobación final.

Conflictos de intereses: Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

 

Literatura citada

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Recibido: 10-XII-2018

Aceptado: 20-II-2019

Publicado online: 10-IV-2019

Publicado impreso:30-IV-2019